Prozessentwicklung zur rekombinanten Produktion von eGFP

In dieser Masterarbeit wurde ein Modellprozess zur Kultivierung eines rekombinanten P. pastoris-Stammes, der über heterologe Expression enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) produziert, aufgebaut. Über einen Softsensor wurde die Biomassekonzentration bestimmt und eine Regelungsstrategie für den Methanol-Feed in der Fed-Batch-Phase etabliert.

Der in vorhergehenden Arbeiten erstellte rekombinante P. pastoris-Stamm, der über heterologe Expression eGFP produziert, wurde in dieser Arbeit als Modellorganismus verwendet. An dem etablierten Modellprozess sollen Sensorneuentwicklungen eingesetzt und getestet werden, um die Eignung dieser Sensoren im realen Prozessumfeld (Funktionsfähigkeit, Störanfälligkeit, Reinigbarkeit etc.) beurteilen zu können.

Während der Prozessentwicklung wurden Kultivierungsstrategien sowohl für die Vorkultur im Schüttelkolben als auch für die Hauptkultur im 30-l-Bioreaktor Biostat® Cplus von der Firma Sartorius Stedim Biotech (Abb. 1) optimiert und standardisiert. Eine Proteinanalytik (SDS-PAGE) wurde für das rekombinante Protein eGFP etabliert; hierdurch wurde eGFP im Kulturüberstand nachgewiesen und quantifiziert. Die Methanolkonzentration, die die höchste Substrataufnahmerate während der Fed-Batch-Phase erzielte, wurde durch ein erweitertes Methanol-Puls-Verfahren ermittelt und verschiedene Ansätze für einen kontrollierten Methanol-Feed (PID-, Fuzzy-Regelung) evaluiert.

Weiterhin wurde ein Softsensor für die Online-Biomasseschätzung aus den gemessenen Prozessparametern (z. B. Abgaskonzentrationen O₂/CO₂, Gelöstsauerstoff) erstellt. Dafür wurden die Regressionsmodelle Multiple Linear Regression (MLR) und Partial Least Squares Regression (PLSR) sowie unterschiedliche Kombinationen von Prozessparametern genutzt. Das beste Ergebnis lieferte ein dreiteiliges MLR-Modell. Schließlich wurde der Bioprozess, bestehend aus Batch-, Übergangs- und Fed-Batch-Phase, dahingehend automatisiert, dass der Methanol-Feed nach beendeter Batch- und Übergangsphase startet.

Zusammengefasst wurde ein kompletter Kultivierungsprozess für einen rekombinanten P. pastoris-Stamm, der eGFP produziert, im 30-l-Maßstab etabliert und teilweise automatisiert.

Lehrstuhl für Brau- und Getränketechnologie, Weihenstephan; Masterand: Michael Metzenmacher; Betreuer: Vincent Brunner; Ansprechpartner: Dominik Geier,